PEWARNAAN BAKTERI ~ Sharing Ilmu

Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Itu berarti bahwa jasad renik ini tipis sekali sehingga tembus cahaya. Akibatnya, bakteri ini akan sangat sulit untuk dilihat dengan teliti di bawah mikroskop. Oleh karena itu, agar dapat dilihat dengan jelas maka bakteri tersebut haruslah diwarnai/dilakukan pengecatan terlebih dahulu.

SEJARAH PEWARNAAN BAKTERI

Pewarnaan bakteri sudah dilakukan sejak permulaan berkembangnya mikrobiologi di pertengahan abad ke- 19 oleh Loius Pasteur dan Robert Koch. Pewarnaan bakteri dapat dilakukan dengan satu macam zat warna ataupun lebih. Pewarnaan bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna disebut pewarnaan sederhana. Pewarnaan dengan menggunakan lebih dari satu macam zat warna diberi nama sesuai dengan nama penemunya. Pada umumnya, ada dua macam zat warna (bahan cat) yang sering dipakai, yaitu sebagai berikut:

Zat warna yang bersifat asam; komponen warnanya adalah anion, biasanya dalam bentuk garam natrium

Zat warna yang bersifat alkalis, dengan komponen warna kation, biasanya dalam bentuk klorida.

Pada pewarnaan sederhana yang sering dipakai adalah methylen blue. Hasil pewarnaannya akan lebih baik bila diberi sedikit KOH (Kalium Hidroksida). Larutan ini disebut Loffer methylen blue.

Cara-Cara Pewarnaan

A. Pewarnaan Sederhana

Tujuan pengecatan ini ialah untuk membedakan bakteri dari benda-benda mati lain yang bukan bakteri dan untuk melihat bentuk dan ukurannya. Larutan cat hanya terdiri dari satu bahan cat yang dilarutkan dalam suatu bahan pelarut. Bahan-bahan yang banyak dipakai untuk keperluan ini adalah karbol fuksin, kristal violet, dan methylen blue.

B. Pewarnaan Diferensial

Untuk pewarnaan ini digunakan lebih dari satu macam bahan cat. Dengan cara ini bahan-bahan cat yang dipakai ada kalanya terpisah, atau ada kalanya dicampur dan digunakan dalam satu larutan. Dua macam pewarnaan/pengecatan yang terpenting dari golongan ini ialah pengecatan Gram dan pengecatan tahan asam seperti pengecatan Ziehl-Naelsen.

Sediaan (preparat) untuk proses pengecatan dibuat sebagai berikut.

Kaca objek dibersihkan sehingga bebas lemak
Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya di sebelah permukaan yang tidak dicat
Dengan ose dibuat film yang tipis pada permukaan yang telah dibersihkan
Film dikeringkan di udara atau dengan hawa hangat dari api gas
Fiksasi dilakukan dengan cara menyentuhkan permukaan kaca objek tiga kali berturut-turut pada ujung api
Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk dicat

Yang dimaksud dengan fiksasi ialah melekatkan bakteri pada kaca objek, mematikan bakteri dengan cepat agar sifat-sifatnya tidak banyak berubah. Fiksasi ini harus dilakukan setelah preparat kering.

a. Pewarnaan Gram (Christian Gram)

Pewarnaan ini pertama kali dikemukakan oleh Christian gram (1884). Dengan pengecatan ini film bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol gentin violet (karbol kristal violet, karbol metilviolet) dan didiamakan beberapa lama, kemudian disiram dengan larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat pengecatan ini selesai, semua bakteri akan berwarna ungu. Untuk lebih jelasnya berikut adalah tahap-tahap pewarnaan;

Sediaan diwarnai dengan karbol gentian violet selama 3 menit
Kelebihan zat warna dibuang tanpa dicuci direndam dalam lugol (J dalam KJ) selama 45 menit detik
Sediaan dicuci dengan alkohol 95% sampai tidak ada lagi zat warna yang luntur
Cuci dengan air mengalir untuk menghilangkan alkohol diwarnai dengan fuchsin selama 3 menit
Cuci dengan air mengalir
Keringkan di antara 2 kertas saring dan dilihat dengan mikroskop

Dengan pewarnaan Gram, ada beberapa bakteri yang dapat menahan zat warna ungu (karbol kristal violet, karbol metilviolet) dalam tubuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol dan aseton. Bakteri yang memberi reaksi semacam ini dinamakan bakteri Gram Positif. Sebaliknya, bakteri yang tidak dapat menahan zat warna setelah didekolorisasi dengan alkhol dan seton akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecetan dengan zat warna kontras akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini dinamakan bakteri Gram Negatif.

b. Pewarnaan Ziehl Neelsen

Pewarnaan ini juga disebut dengan pengecetan tahan asam. Disebut demikian karena pada beberapa jenis bakteri sukar dilakukan pengecetan. tetapi sekali dapat tercat tidak mudah untuk dilunturkan meskipun dengan menggunakan zat peluntur (decolorizing agent) asam (atau asam-alkohol). Yang termasuk bakteri yang sukar dicat adalah dari genus Mycrobacterium (Mycrobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium smegmatis). Bakteri tahan asam sangat banyak mengandung lipida, asam lemak, dan kandungan inilah yang mencerminkan sifat tahan asam pada golongan bakteri tersebut antara lain asam mikolat. Cara pengecetannya ialah :

Film bakteri pada kaca objek yang telah difiksasi, disiram dengan karbolfuksin, kemudian dipanaskan sampai keluar uap (tidak sampai mendidih). Pemanasan diulang beberapa kali agar bahan cat tetap hangat kemudian didiamkan selama lima menit.
Dekolorisasi dilakukan dengan asam-alkohol dalam waktu yang singkat, kemudian cepat dicuci dengan air.
Pengecetan dengan cat kontras dilakukan dengan metil biru dalam larutan KOH 1/10000
Setelah dicuci kembali dengan air preparat dikeringkan di udara.

Dengan pewarnaan ini, bakteri dibagi dalam 2 golongan, yaitu:

Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast)
Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non-acid fast)

c. Pewarnaan Neisser dan Albert

Di antara bakteri bentuk batang Gram positif, ada yang di dalam selnya ditemukan granula polifosfat yang disebut juga granula metakromatik atau volutin bodies. granula ini bersifat kromofil dan metakromatik yang berarti mempunyai aktivitas kuat terhadap zat-zat warna, dan seringkali tampak lain dari zat warna yang diberikan. Berikut adalah langkah-langkah pengecetannya:

1. Sebagai bahan cat disediakan tiga macam larutan, yaitu:

Neisser A isinya methylen blue
Neisser B isinya gentian violet
Neisser C isinya chrysoidin (berwarna kuning)

2. Untuk pengecetan pertama digunakan larutan A dan B yang dicampur sesaat sebelum pengecatan dalam perbandingan dua bagian larutan A dengan satu bagian larutan B. Lama pengecatan adalah setengah menit

3. Setelah campuran tersebut dibuang preparat dibilas dengan larutan dan larutan ini didiamkan di atas film preparat selama ½ - 1 menit, kemudian dikeringkan dengan kertas saring.

Selain itu, untuk menonjolkan granula metakromatik ini dapat pula dilakukan pengecetan Albert, yaitu:

Preparat dicat dengan larutan cat menurut Albert selama 3-5 menit
Setelah dicuci dengan air, preparat disiram dengan larutan iodium (menurut Gram) dan ditunggu satu menit. kemudian dicuci kembali dengan air dan dikeringkan dengan kertas saring.

Hasil Pengecetan:

1. Pada pengecetan Neisser: Granula berwarna biru-hitam, sitoplasma berwarna kuning (krisoidin) atau tengguli/kecoklat-coklatan (Bismarck brown)

2. Pada pengecetan Albert: Granula berwarna biru-hitam, sitoplasma hijau

***Semua bakteri Gram negatif tidak tahan asam, sedangkan bakteri Gram positif ada yang tahan asam dan ada yang tidak tahan asam***